lunes, 23 de enero de 2017

Respuesta inmune Th1 en la osteoartritis de la articulación temporomandibular

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RESUMEN

Propósito. La osteoartritis temporomandibular es una enfermedad articular degenerativa, caracterizada por la destrucción del cartílago y hueso articular consecutiva a la respuesta inflamatoria e inmune desarrollada. En el presente trabajo se evalúa la expresión a nivel de ARN mensajero de diversas citoquinas proinflamatorias en los sinoviocitos articulares de individuos afectados por osteoartritis temporomandibular. 

Material y métodos. En 12 pacientes afectados de osteoartritis temporomandibular y en 6 sujetos sanos se evaluó la expresión de citoquinas en sinoviocitos de la articulación temporomandibular mediante la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real. 

Resultados. Significativamente mayores niveles de IL-1b, IL-2, IL-12, IL-17, TNFa, TNFb e IFNg fueron observados en pacientes afectados de osteoartritis temporomandibular en comparación a sujetos sanos. En los sujetos enfermos la citoquina predominante fue IL-12 y en los sanos fue IL-10. 

Conclusión.
 Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran una asociación de elevados niveles de citoquinas propias de una respuesta inmune Th1 y la destrucción observada durante la osteoartritis temporomandibular.

Palabras clave: Articulación temporomandibular, citoquinas, respuesta inmune Th1.

Introducción

Los trastornos temporomandibulares corresponden a un conjunto de patologías de etiología y sintomatología diversa que afectan a la musculatura masticatoria, las articulaciones temporomandibulares (ATM) y sus estructuras asociadas1,2. La osteoartritis (OA) corresponde a un trastorno degenerativo de las ATM caracterizado por una degradación del cartílago articular y una destrucción ósea reaccional1,2. Variables grados de inflamación han sido descritos en la literatura científica, en donde se ha propuesto que varios mediadores inflamatorios, tales como interleuquina (IL) -1, IL-6, factor de necrosis tumoral-alfa (TNFa) y prostaglandina E2(PGE2), servirían como marcadores de activa degeneración de la ATM durante la OA3,4. A pesar de los recientes avances en el conocimiento de las bases celulares y moleculares de la patofisiología de la OA muchos aspectos de su etiopatogenia quedan aún por resolver. El objetivo de este trabajo es determinar el tipo de respuesta inflamatoria predominante en las ATM de individuos afectados de OA, a través de la evaluación de los niveles de IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, TNFa, TNFb e IFNg presentes, mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa (qPCR).

Material y Métodos
Selección de los pacientesFueron estudiados 12 pacientes (4 hombres y 8 mujeres con edad promedio de 41,42,4 años) con el diagnóstico clínico de OA temporomandibular. Los criterios clínicos diagnósticos fueron: Impedimento de la movilidad articular, dolor articular y cambios degenerativos en las superficies óseas articulares evaluada mediante tomografía. Los pacientes fueron evaluados y los datos clínicos fueron registrados por 2 evaluadores independientes y la toma de muestra se procedió a realizar habiendo interrumpido el tratamiento farmacológico indicado en al menos 2 semanas previas. Como grupo control fueron evaluados 6 individuos sanos (2 hombres y 4 mujeres con edad promedio de 39,02,2).

Colección de la muestra
Las muestras de fluido sinovial fueron obtenidas mediante anestesia local extracapsular de la ATM. 2 mL de suero fisiológico fue inyectado en el compartimiento superior de la articulación y 1 minuto después 2 mL de una mezcla de solución salina y fluido sinovial fue aspirada y centrifugada para la obtención de células sinoviales, las que fueron inmediatamente sumergidas en 5 mL medio de cultivo estéril RPMI 1640 suplementado con 50 UI/mL de penicilina, 50 µg/mL de estreptomicina, 200 mM de L-glutamina (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) y 10% de suero bovino fetal (Gibco Invitrogen, Grand Island, NY, USA), y mantenidas a 4ºC para posterior extracción de ARN total.

Extracción de ARN total
Previo lavado 2 veces en PBS, las células fueron resuspendidas en 400 µL de amortiguador de lisis NP40 suplementado con VRC 10 mM y sometidas a agitación constantemente durante 10 segundos hasta lograr completa lisis celular. Posterior a centrifugación a 18.000 xg, 350 µL de sobrenadante fue resuspendido en 20 µL de SDS, 12 µL de EDTA 0,5 M y 10 µL de proteinasa K 10 mg/mL, para ser incubadas durante 30 minutos a 37ºC. 400 µL de fase acuosa se obtuvo luego de agitación vigorosa en 400 µL de cloropán durante un minuto, a partir de la cual se procedió a la precipitación del ARN en 40 µL de acetato de sodio 3 M, 1 µL de glicógeno y 1 mL de etanol 100% durante al menos 1 hora a –20ºC. El ARN total se precipitó en 20 µL de agua libre de ARNasas.

Construcción de la primera cadena de cDNA
La primera cadena de cADN se construyó utilizando el kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science, Mannhein, Germany). Brevemente, 1 µg de ARN total fue retrotranscrito en termociclador (MWG AG Biotech, Germany) en 20 µL de volumen final de primeros hexaméricos aleatorios 60 µM, inhibidor de ARNasas 20 U, mezcla de deoxinucleótidos 1 mM y enzima transcriptasa reversa 10 U en agua libre de ARNasas, en las siguientes condiciones: Incubación inicial a 25ºC durante 10 minutos y luego 2 incubaciones a 50ºC durante 1 hora y 85ºC durante 5 minutos. Las muestras fueron almacenadas a –20ºC hasta posterior amplificación mediante qPCR.

PCR cuantitativo
Para evaluar a expresión de IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, TNFa, TNFb e IFNg se procedió a realizar amplificación en termociclador en tiempo real ABI PRISMTM 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems, CA, USA) utilizando el kit FastStart TaqMan Probe Master (Roche Applied Science). Brevemente, 1 µg de cADN fue amplificado en 20 µL de volumen final con FastStart TaqMan Master 1x, sonda de hidrólisis 250 nM, primer específicos (Tabla 1) 900 nM cada uno, en agua libre de ARNasas en las siguientes condiciones: 1 ciclo de 95ºC durante 10 minutos y 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto.

Análisis de los datos
Los datos fueron expresados como Ct, DCt y cuantificación relativa RQ y analizados con el software estadístico SPSS 13.0 (Lead Technologies Inc., Charlote, NC, USA). El test Shapiro-Wilk fue utilizado para determinar distribución normal de lo datos. La prueba estadística t de Student no pareada de 2 colas fue utilizada para analizar cada citoquina entre el grupos control y experimental. La prueba ANOVA no pareada de 2 colas y la prueba de Tukey se utilizaron para comparar los niveles de citoquinas dentro del grupo control y del experimental. Un p<0,05 fue considerado como diferencia estadísticamente significativa.
Resultados
Los valores Ct de cada citoquina y los valores DCt de cada citoquina ajustada al gen housekeeping 18S se resumen en la tabla 2. El Ct de 18S fue similar entre grupo experimental y control (22,2881,94 vs. 22,3491,34). Los valores Ct y DCt de IL-1b, IL-2, IL-12, IL-17, TNFa, TNFb e IFNg fueron significativamente mayores en pacientes con OA temporomandibular en comparación a sujetos sanos. El Ct, pero no el DCt, de IL-5 fue significativamente mayor en pacientes con OA versus controles sanos. Al analizar la cuantificación relativa RQ de cada citoquina (Tabla 3) se observó que IL-12 fue la que se sobre-expresó con mayor intensidad en sujetos con OA temporomandibular (30,2 y 29,0 para IL-12 p35 e IL-12 p40, respectivamente), IL-1b, IL-2, IL-17, TNFa, TNFb e IFNg se sobreexpresaron en cantidades moderadas e IL-10 se observó expresado con mayor intensidad en individuos controles sanos.
Discusión
Durante la OA temporomandibular se desarrolla un complejo proceso inflamatorio que involucra la síntesis de una serie de citoquinas por parte de los sinoviocitos y células infiltrantes inflamatorias, principalmente del tipo linfocitario T1,2. La cascada de mediadores inflamatorios secretados lleva a la sobreexpresión de citoquinas involucradas en la activación de fibroblastos que secretan metaloproteinasas y de precursores celulares de osteoclastos, mediante citoquinas osteoactivas, que llevan a diferenciación y activación de osteoclastos, que en definitiva causan la destrucción de la matriz orgánica y mineral del cartílago y hueso articular, característicos de la patología1,2.
Diferentes mediadores inflamatorios han sido propuestos como potenciales marcadores de la degeneración articular durante la OA3,4. Estudios recientes han evaluado la asociación de citoquinas proinflamatorias y trastornos temporomandibulares diversos, en donde, mediante ELISA, se ha establecido que IL-1, IL-6, TNFa, y PGE2 se encuentran asociados al daño articular4,5.
Nuestro estudio evaluó los niveles de distintas citoquinas en su asociación al diagnóstico clínico de AO temporomandibular. Mediante qPCR se observó significativamente mayores niveles de IL-1b, IL-2, IL-12, IL-17, TNFa, TNFb e IFNg en sujetos enfermos.
Los linfocitos T ayudadores (Th) del tipo CD4+ pueden funcionalmente se divididos en al menos 2 subtipos, Th1 y Th2, de acuerdo al patrón de citoquinas que ellos expresan al ser activados6. Una respuesta Th1 se caracteriza por un predominio en la síntesis de citoquinas IL-1b, IL-2, IL-12, TNFb e IFNg y se relaciona con una respuesta de tipo celular, en donde neutrófilos y macrófagos cumplen un rol esencial en el desarrollo de la patología7. Por otro lado, una respuesta Th2 se caracteriza por la expresión de citoquinas tipo IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13, y se relaciona con una respuesta del tipo humoral, en donde predomina la síntesis de inmunoglobulinas reactivas a los antígenos desencadenantes de la respuesta inmune7.
Entre los factores determinantes del tipo de respuesta Th desarrollado se puede enumerar: El tipo de antígeno desencadenante de la respuesta, como este antígeno es presentado por las células presentadoras de antígeno (APCs) a los linfocitos T efectores, el tipo se señales co-estimulatorias expresadas por las APCs, y, principalmente, el ambiente de citoquinas existente8. A este respecto, se ha establecido que IL-12 promueve la diferenciación a un fenotipo Th1, mientas IL-4 promueve la diferenciación Th28.
En la actualidad, respuestas distintas al tipo Th1 o Th2 han sido propuestas, tales como, Th17 dependiente de un predominio de IL-17, y respuesta Th3, asociada a un predominio de IL-109,10, profundizado el conocimiento en el tipo de citoquina sintetizado durante el proceso inflamatorio y enfatizando la importancia del tipo de respuesta en el resultado final de la enfermedad11.
IL-10 y TGFb (factor de crecimiento transformante-beta) se han descrito como citoquinas inmunosupresivas y se han propuesto como mediadores esenciales en la diferenciación y actividad de linfocitos T reguladores tipo 1 (Tr1) y Th312. Las propiedades inmunosupresivas de las células Tr1 y T3 pueden probablemente ser explicadas por la propiedad de las citoquinas en inhibir la función de las APCs. Células dendríticas tratadas in vitro con IL-10 disminuyen la síntesis de citoquinas proinflamatorias, incluyendo IL-1b, IL-6, TNFa e IL-12, inhibiendo la inducción de células Th1 específicas al antígeno y regulando la respuesta de las células T efectoras13.
En forma similar a reportes previos, nuestros datos muestran que mayores niveles de citoquinas se encuentran asociados a desórdenes de la ATM en comparación a controles sanos5,14,15. A partir de los datos obtenidos de nuestro estudio se puede concluir que una respuesta del tipo Th1 se establece en las ATM de individuos afectados de OA, en donde un predominio de IL-12 es característico de la lesión. Por otro lado, sujetos sanos muestran un predominio de IL-10, pudiéndose conjeturar una potencial respuesta reguladora, en donde linfocitos Th3 cumplirían un rol fundamental durante la salud articular. Una respuesta Th1, activaría mecanismos asociados a la síntesis de metaloproteinasas y de RANKL por parte de los fibroblastos articulares, este último asociado a la estimulación de la diferenciación y activación de monocitos a osteoclastos maduros, desencadenándose la destrucción del cartílago y hueso articular durante la OA de las ATM16,17.
En el futuro, la evaluación de las citoquinas proinflamatorias como marcadores de la destrucción articular podrían ser útiles en el diagnóstico y monitoreo de los desórdenes de la ATM. Nuevos estudios son necesarios para dilucidar la distribución temporoespacial de las citoquinas, la relación sinérgica y antagonista de ellas, el rol de su relación a sus receptores específicos y los mecanismos regulatorios involucrados en la aparición y desarrollo de la enfermedad.

Referencia; http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0213-12852007000200003

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