jueves, 29 de marzo de 2012

Aplicaciones de nutrigenómica en cáncer


El cáncer es una enfermedad compleja de origen genético que se caracteriza por la acumulación de mutaciones y cambios genéticos a lo largo de la vida (Weinberg 2007). Existen cerca de doscientos tipos de cáncer y cada uno de ellos puede presentar diferentes subtipos. Dada la existencia de múltiples genes y proteínas implicados en el desarrollo del cáncer, cada tipo de cáncer requiere un diagnóstico y tratamiento preciso y diferente.

La biotecnología juega un papel clave en el suministro de herramientas y reactivos que facilitan un mejor estudio, control, diagnóstico, pronóstico y terapia del cáncer. Hasta la aparición de la genómica y la proteómica, la clasificación de los tumores se hacía de acuerdo a su localización y a su estadío de progresión clínica, siempre con la ayuda de las técnicas histológicas e inmunohistoquímicas. Resulta evidente, a partir del conocimiento acumulado en la biología molecular del cáncer, que la información histopatológica es de carácter limitado y no informa sobre las bases moleculares que activan el desarrollo del tumor, ni por tanto sobre la eficacia que un determinado tratamiento anti-tumoral tendrá en el paciente.

GENOMICA DEL CANCER

La finalización de la secuencia del genoma humano inició la era Genómica en la que nos encontramos. El conocimiento de la secuencia completa del Genoma Humano y de los aproximadamente 30.000 genes que lo componen permitió, entre otros aspectos, la puesta a punto de los llamados chips, o microarrays, de DNA, que permiten el examen completo de un genoma en un solo experimento.

Un chip de DNA es un pequeño dispositivo, generalmente del tamaño del portaobjetos de un microscopio, que contiene impresas miles o decenas de miles de secuencias de DNA que representan a cada uno de los genes que componen el genoma y que son llamadas sondas (Figura 1). La superficie de impresión es generalmente un cristal modificado con algún componente químico que permite el anclaje estable del DNA. La naturaleza y tamaño de las sondas puede variar. Así los chips originales estaban formados por moléculas de cDNA de tamaño variable, entre 300 y 500 pares de bases que se obtenían por amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de un clon de cDNA (Schena, Shalon et al. 1995). Este tipo de sondas ha sido reemplazado posteriormente por sondas basadas en oligonucleotidos sintetizados químicamente y de longitud variable entre 25 nt (Affymetrix) y 60 nt (Agilent). El uso de oligonucleotidos permite la preparación de los llamados chips de genoma completo, que contienen una representación de los 30.000 genes del genoma.






Figura 1. Imagen de un Oncochip CNIO. El Oncochip consta de 9.300 genes humanos relacionados con el cáncer y distribuidos en 22.300 manchas (spots) impresos.



La principal aplicación de los chips de DNA en cáncer ha sido el estudio de la expresión genética diferencial entre muestras pareadas (tumorales y normales) del mismo individuo enfermo. Se trata de comparar los genes que se encuentran alterados en el tejido tumoral respecto al normal, tanto activados (mayor expresión) como reprimidos (menor expresión). La colección de genes alterados constituye una firma molecular del tumor objeto de estudio. Mediante el uso de estas firmas moleculares es posible, por tanto, clasificar molecularmente los tumores y estratificar los pacientes en diferentes grupos atendiendo a diferentes criterios: mejor o peor pronóstico, mayor o menor susceptibilidad a fármacos, etc.

Para realizar un experimento de expresión genética diferencial es necesario aislar los RNAs mensajeros tanto de la muestra tumoral como de la normal, amplificarlos y convertirlos en cDNA a la vez que se marcan con dos fluorocromos distintos, generalmente Cy5 (rojo), para el tumoral, y Cy3 (verde), para el normal. Los dos cDNAs marcados se mezclan, se añaden al chip de DNA y se dejan reaccionar durante un cierto tiempo. A continuación el chip se lava para eliminar cualquier resto de DNA que no se haya unido específicamente y se lee con un “scanner” para detectar el DNA marcado con fluorocromos que se haya hibridado específicamente. Si existe mayor abundancia (lo que indica mayor expresión) de un gen en el tejido tumoral, la imagen revela la mancha (el spot) resultante de color rojo. Si hay una disminución o pérdida (menor expresión) de un gen, el spot resultante será verde. Si la expresión es similar o equivalente en ambos casos el color resultante será amarillo. Tras realizar el correspondiente análisis bioinformático se obtiene un código de colores que constituye la firma molecular y es un reflejo del nivel de expresión de los diferentes genes en ese determinado tumor.

La Figura 2 ilustra los resultados de un experimento de clasificación molecular del linfoma difuso de célula B grande. A pesar de que todas las células de este tumor tienen el mismo aspecto a nivel microscópico, el estudio de la expresión génica con los arrays de DNA permitió dividir este tumor en tres enfermedades diferentes, con un pronóstico clínico muy diferente entre ellas –linfoma primario de célula B de mediastino, linfoma de célula B de centro germinal y linfoma de células B activadas. De la misma manera, dos de los subtipos expresan altos niveles de NF-B, lo cual las convierte en mejores dianas para ciertos fármacos (Rosenwald, Wright et al. 2002).





Figura 2. Estratificación de pacientes de linfoma difuso de célula B grande. El uso de microarrays de DNA permite la separación de este tipo de linfomas en tres subgrupos distintos con distinta firma molecular y muy diferente pronóstico. Los tres subgrupos son indistinguibles por técnicas histológicas convencionales. Tomado de Rosenwald et al (2003) J. Exp. Med 198, 851-862.


En otro experimento (Fig. 3), un grupo de 295 pacientes de cáncer de mama fueron divididas en dos grupos, en uno, las que desarrollaban metástasis en nódulos linfáticos y en otro, aquellas que no desarrollaban metástasis. El análisis de la expresión génica en estos dos grupos de pacientes utilizando microarrays de DNA permitió distinguir una firma molecular de 70 genes pronósticos, cuya expresión podía utilizarse para estratificar las pacientes con cáncer de mama en aquellas con “buen pronóstico” y aquellas con “mal pronóstico” (van de Vijver, He et al. 2002). Dado que aquellas pacientes clasificadas con buen pronóstico no se benefician en absoluto del tratamiento con quimioterapia, es posible ahorrar este tratamiento y sus molestos efectos secundarios.



Figura 3. Estratificación de pacientes con cáncer de mama. Utilizando microarrays de DNA sobre un grupo de 295 pacientes se ha podido detectar un conjunto de 70 genes pronósticos que agrupan las pacientes en dos grupos, aquellas que presentan una buena firma molecular con una probabilidad baja de desarrollar metástasis y aquellas que presentan una mala firma con alta probabilidad de desarrollar metástasis. Tomado de “The Biology of Cancer” R. Weinberg. Garland Science.

Mas allá de los análisis de expresión génica, han comenzado a aparecer en los últimos años nuevos métodos diagnósticos basados en la aplicación de técnicas proteómicas a la investigación del cáncer.

PROTEÓMICA DEL CÁNCER
La proteómica se define como el estudio global del proteoma de un individuo, entendiendo por proteoma el conjunto de proteínas que se obtiene de traducir los genes que componen un genoma en un determinado momento. Existe pues una primera y clara diferencia entre el proteoma y el genoma. Mientras que el genoma de un individuo permanece constante a lo largo de su vida, el proteoma es dinámico y cambiante según la edad, condición, tipo celular, etc…Se puede afirmar que el proteoma es varias órdenes de magnitud mas complicado que el genoma. Esta complejidad se basa no solo en su dinámica sino en el número de entidades a caracterizar. Se calcula que si tenemos en cuenta todas las posibles modificaciones post-traduccionales (fosforilaciones, glicosilaciones, acetilaciones, etc) junto con los diferentes procesamientos que puede sufrir el mRNA no es descabellado hablar de aproximadamente 1.000.000 de proteínas diferentes que pueden componer el proteoma humano.

Actualmente, el termino proteómica se utiliza para describir la totalidad del análisis funcional de los productos génicos, desde la localización a gran escala o la monitorización de la expresión de miles de proteínas simultáneamente hasta el estudio de su dinámica y sus interacciones. La promesa de la proteómica es que a través del estudio de muchos componentes simultáneamente, aprenderemos como las proteínas interaccionan entre si y con otras moléculas no proteicas, para controlar procesos complejos en células, tejidos e incluso a nivel de organismos completos, en los que ahora se denomina biología de sistemas.

Al igual que ocurre en el caso de la genómica, la proteómica aplicada al cáncer se ha centrado fundamentalmente en la búsqueda de marcadores proteicos diferencialmente expresados en tumores y nuevas dianas terapéuticas (Hanash 2003). El primer paso en cualquier estudio proteómico es la separación de proteínas. Existen múltiples métodos para la separación de proteínas, pero sin duda el método proteómico clásico ha sido la electroforesis bidimensional.

La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas complejas de proteínas. La base de su elevado poder de resolución estriba precisamente en su carácter bidimensional, es decir que las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos. En primer lugar las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque). Tras esta separación basada en la carga ,las proteínas son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS). Tras la tinción del gel, las proteínas aparecen formando manchas circulares (spots). En cada experimento de geles bidimensionales se pueden detectar varios miles de proteínas.

Esta alta resolución se puede aplicar al estudio de la expresión diferencial de proteínas en diversas situaciones, por ejemplo, tratamiento de líneas celulares con fármacos, comparación de tejidos sanos con enfermos, líneas celulares normales y tumorales, etc. Recientemente se ha puesto a punto un nuevo sistema llamado DIGE de su nombre en inglés (Differential in gel electrophoresis) que simplifica enormemente este tipo de análisis diferencial a través del marcaje simultáneo con dos fluorocromos diferentes de los extractos proteicos a comparar y carga igualmente simultánea en el mismo gel con un estándar interno para el proceso de normalización de datos entre experimentos (Fig. 4). Este método permite comparar diferentes experimentos entre si y detectar variaciones muy pequeñas de proteínas entre muestras.




Figura 4. Electroforesis bidimensional de tejido tumoral humano. Extractos proteicos obtenidos a partir de una muestra pareada (tumoral/ normal) de cáncer colorectal fueron marcados con los fluorocromos Cy3 y Cy5 y sometidos a electroforesis bidimensional. Las proteínas sobreexpresadas en tumores aparecen de color rojo, las reprimidas en tumores frente al normal aparecen de color verde.


La electroforesis bidimensional permite analizar la expresión de miles de proteínas a la vez, pero a diferencia de los microarrays de cDNA, los perfiles de expresión que se obtienen son anónimos, es decir la única información asociada a cada spot es su intensidad normalizada y sus coordenadas en el espacio (pI y Mr aproximados). Por tanto se necesitan otros métodos para proceder a la identificación de estas proteínas. Las nuevas técnicas de espectrometría de masas (MS) han sido definitivas en este aspecto (Domon and Aebersold 2006). Se basan en la digestión de las proteínas separadas en gel y el análisis de los péptidos para determinar con gran precisión su masa y/o obtener su secuencia de aminoácidos.

La técnica mas utilizada por sencillez y capacidad de procesamiento de múltiples muestras es la identificación de la huella peptídica, que se realiza por digestión con tripsina y análisis de la masa de los péptidos resultantes por espectrometría de masas MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization, time of flight). En este equipo las proteínas se embeben dentro de una matriz que al ser bombardeada con un láser se ioniza y transfiere esa energía a los péptidos para su ionización. Aplicando una diferencia de potencial, los péptidos cargados vuelan hasta el detector y el tiempo de vuelo es proporcional a la masa del péptido. Con este método se obtiene un espectro de las masas de todos los péptidos resultantes del proceso de digestión tríptica. Dado que la tripsina tiene puntos de corte muy específicos, los péptidos que se obtienen son muy reproducibles y por tanto cada proteína debe tener una huella de péptidos trípticos única. Los espectros de masas obtenidos se usan para contrastar con (interrogar) bases de datos (p.e. SwissProt, NCBI) con los algoritmos adecuados (MASCOT, ProFound, etc) para identificar las proteínas que corresponden a cada uno de los spots de interés.

Sin embargo para determinar inequívocamente a que proteína corresponde cada spot es conveniente realizar una secuencia del péptido producido, para ello se utiliza otro tipo de espectrometría de masas, llamada tandem MS/MS (p.e. realizada con una trampa iónica). En este tipo de espectrometría, los péptidos sufren una nueva rotura a nivel de enlace peptídico en cada uno de los residuos que componen el péptido. Dado que esta rotura es dependiente de la secuencia, el espectro MS/MS de un péptido representa su secuencia de aminoácidos. La secuencia de un péptido nos dirá de forma inequívoca de que proteína se trata. Los equipos de trampa iónica también son muy utilizados para la determinación de las modificaciones post-transduccionales de las proteínas, esto es, fosforilaciones, glicosilaciones, etc.

La proteómica clínica es la combinación de las técnicas descritas anteriormente (geles 2D con LC-MS) y bioinformática, junto a nuevas herramientas como los arrays de proteínas para el descubrimiento de nuevos biomarcadores. Los arrays de proteínas y anticuerpos permiten analizar el proteoma a escala global con una sensibilidad muy superior a la obtenida actualmente por espectrometría de masas. Si unimos a esta sensibilidad la exquisita especificidad de la unión antígeno-anticuerpo nos encontramos con una herramienta muy útil para la identificación de proteínas y marcadores expresados a muy bajo nivel, incluidos autoanticuerpos, la discriminación e identificación de diferentes isoformas y el análisis global de complejas rutas de señalización.

Aunque la proteómica se esta estableciendo como una técnica fundamental para la investigación del cáncer no está aun clara su implementación a nivel clínico. La complejidad tecnológica, el alto coste del equipamiento necesario, su difícil automatización, junto a la poca disponibilidad de personal bien formado dificultan la predicción de en que momento la proteómica se trasladará a la práctica clínica rutinaria.

REFERENCIAS

Domon, B. and R. Aebersold (2006). "Mass spectrometry and protein analysis." Science 312(5771): 212-7.
Hanash, S. (2003). "Disease proteomics." Nature 422(6928): 226-32.
Rosenwald, A., G. Wright, et al. (2002). "The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma." N Engl J Med 346(25): 1937-47.
Schena, M., D. Shalon, et al. (1995). "Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray." Science 270(5235): 467-70.
van de Vijver, M. J., Y. D. He, et al. (2002). "A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer." N Engl J Med 347(25): 1999-2009.
Weinberg, R. A. (2007). The biology of cancer. New York ; London, Garland Science.


LINKS DE INTERES

http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html
Página web de ensembl para explorar en profundidad el genoma humano

http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html
Página web de MIAME, organización para la estandarización de resultados en microarrays

http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/
Página web de Array Express para el depósito de datos obtenidos con microarrays de DNA

http://www.genecards.org/
Página web de Genecards para conocer mejor las propiedades y características de los genes descritos hasta la fecha

http://proteomics.cancer.gov/
Iniciativa de Proteómica y Cáncer del Instituto Nacional del Cáncer de los EEUU

http://www.proteinatlas.org/index.php
Atlas de proteínas humanas y su expresión tanto en tejidos normales como tumorales

http://www.hprd.org/
Extensa información sobre proteínas humanas

http://us.expasy.org/sprot/
Base de datos conteniendo secuencias y características de las proteínas descritas hasta la fecha

http://www.goproteomics.com/
Portal de entrada a diversa información de utilidad en el campo de la Proteómica

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